流式细胞仪的结果图怎么看？

流式细胞术系统性地结合流体学、光学和电子系统，利用其荧光和物理特性检测各种微粒体。它是一种有效地从单细胞水平区分异质性细胞群体的技术。利用流式细胞仪对处在快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选。

流式细胞仪在收集大量细胞的基础上，可以根据细胞荧光强度的差异，从混合细胞群中鉴别出不同亚群，并对每一亚群的比例做出精确定量（图1）。

图1 流式细胞仪分选目标细胞的原理

使用流式细胞仪，就需要看懂流式细胞图。流式细胞图常见的有单参数直方图、散点图、等高线图等（图2）。要看懂流式细胞图，需要先了解流式通道这个概念。

图2 常见的流式细胞图

流式通道主要分为散射光通道和荧光通道。散射光通道有两种，包括前向散射光（Forward Scatter，FSC）通道和侧向散射光（Side Scatter，SSC）通道，而不同型号的流式细胞仪其荧光通道（Fluorescent Channels）的多少差异较大，有的甚至没有荧光通道（图3）。

图3 流式通道组成

散射光通道

借助流体系统，细胞悬液在通过流式细胞仪时，从小喷嘴中流出的细胞悬液在鞘液的流体力学作用下向中心聚拢，形成的细流可使细胞依次通过激光束，且一次仅一个细胞。

借助光学系统，当细胞通过激光束时，检测器会检测到细胞或颗粒的散射光，放置在前面的检测器检测FSC，而放置在侧面的多个检测器检测SSC。

FSC值代表细胞的大小，细胞体积越大，其FSC值就越大。

SSC值代表细胞的颗粒度（与细胞中所含的细胞器、细胞核等的数量成正比）。细胞越不规则，细胞表面的突起越多，细胞内能够引起激光散射的细胞器或者颗粒性物质越多，其SSC值就越大。

因此，借助FSC或SSC检测到的散射光，即根据细胞大小和颗粒度差异可区分各个细胞群。

荧光通道

荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征，而是其化学特征。

如需要检测样品中是否有细胞表达某一分子，可以将该分子的抗体与特定的荧光素偶联，这种荧光素通过荧光通道时会被激发而产生荧光。这样该抗体与被检细胞结合后，就可以被识别到，也就能得到该样品中是否有细胞表达该分子（即区分阳性细胞和阴性细胞），以及有多少比例的细胞表达该分子等信息。

在了解了流式通道后，我们接着介绍流式细胞图（不同的展示形式）所表达的含义。

单参数直方图

直方图的横坐标代表荧光信号或散射光信号的相对强度，可以是线性或对数坐标；纵坐标一般是Count（细胞数）（图4）。

在表型分析中，荧光信号强弱直接反映细胞抗原的丰度。在检测细胞自表达的荧光蛋白过程中，荧光信号的强弱反映目的基因的表达量。

在核型/细胞周期分析中，荧光信号的强弱反映的是DNA或染色体的含量。

图4 单参数直方图

散点图

散点图能够同时表示两个通道的信息，更加直观和常用，横坐标/纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线性或对数坐标，图中每一点代表一个细胞。

比如前向/侧向散点图的横纵轴分别为FSC与SSC，如上文所述反映的是细胞大小和内容物的多少（图5）。

在流式操作过程中，最开始都会生成前向/侧向散点图来观察细胞群的物理性质，通过该图可以圈出研究人员感兴趣的细胞群，在后续操作中做进一步分析。

图5 前向/侧向散点图

又如荧光强度散点图（图6），它在实际操作中最为常见，图中不带有两种荧光的细胞（即“阴性细胞群”）会被分在Q1，就是两种荧光强度都很低的细胞群；相应地，Q3中的点就代表两种荧光强度都很高的“双阳性”细胞群。

剩下的Q2和Q4中的点，代表单荧光标记的“单阳”细胞群。通过观察两种荧光染色的细胞分布，就可以判断双阳/单阳比例，进而圈出需要进一步研究的细胞群体。

图6 荧光强度散点图

这里以流式细胞仪检测细胞凋亡为例，看荧光强度散点图是如何反映细胞凋亡的。先做简单的检测原理介绍，Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法，它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine, PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的。

Annexin Ⅴ是检测细胞凋亡的灵敏指标之一，是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合，将Annexin V 进行荧光素FITC标记，利用流式细胞仪可以更早地检测细胞凋亡的发生。而碘化丙啶（Propidium, PI）是一种可与DNA结合的染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染色。所以两者结合可以区分活细胞、凋亡细胞、以及坏死细胞。

这体现在荧光强度散点图上（图7），就是Q1为Annexin V^-PI⁺，可能是已经没有细胞膜的细胞碎片，或者其他原因导致的坏死细胞；Q2为晚期凋亡细胞或坏死细胞Annexin V⁺/PI⁺；Q3为正常（活）细胞Annexin V^-/PI^-；Q4为早期凋亡细胞Annexin V⁺/PI^-。

需要注意，该检测方法不能区分经历凋亡的细胞和因坏死而死亡的细胞，在任一情况下，死细胞都会被Annexin V和PI染色。

 图7 流式细胞仪检测细胞凋亡

等高线图

流式等高线图借助地理等高线图来表示细胞的密集程度，其中的环线代表的是细胞密度相同的区域（图8）。

等高线越密集的地方表示此区域细胞密度变化越快，环线的中央区域代表细胞聚集的中心。

等高线图有其独特的优点，能直观地体现细胞群的集中点，等密度环线的中央区域代表一个细胞群的集中点，一般代表一个细胞群。

在某些情况下，等高线图比散点图更能直观地体现细胞的分群（图8红框）。

图8 等高线图

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